基因交融（Gene Fusion）是指两个差别基因的部门序列或全数序列交融到一路，构成了一个新的基因。基因交融的常见机造有染色体易位、插入缺失及倒位等。越来越多的研究表白，基因交融与各类疾病，出格是癌症的发作开展慎密相关，以至是一些癌症的间接诱因。因而对交融基因的精准检测，关于肿瘤患者的诊断、用药及预后等临床诊疗过程具有重要意义。
目前常用的交融检测手段有免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC），荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH），实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）及下一代测序手艺（Next-Generation" Sequencing technology，NGS）（图1），此中NGS交融检测根据接纳的检测底物又可分为DNA-NGS及RNA-NGS，差别的交融检测办法各有利弊（表1）。
图1 常见的几种交融检测办法
表1 常见的几种交融检测办法好坏势比力
以费城染色体样急性淋巴细胞白血病（ph-like ALL）为例，目前已经发现了近百种交融（图2）[1,2]。传统的检测手段IHC、FISH及qPCR受通量的限造，难以一次性对那么多种交融停止筛查，而NGS恰好具有那种优势，可一次性对多种交融停止大规模筛查。那么选择哪一种NGS道路停止交融检测呢？
图2 Ph-like ALL次要的交融基因家族
在DNA程度上，交融断点位置凡是发作在较长的内含子区域，且交融的断裂点差别患者可能差别，因而接纳DNA-NGS手艺设想探针去抓取断裂点不成制止地存在一个问题，即：为包管准确地找到交融断裂点，探针设想需要笼盖十分冗长且含有大量反复序列的内含子区域，形成检测成本增加的同时，那些内含子区域可能存在高GC、位于repeat区等一系列影响探针捕捉效率及序列比瞄准确性问题。而比拟DNA，RNA程度上交融基因表示为前后两个基因外显子之间的跟尾，交融点相对固定（图3）。那一特征使得精准设想探针更为容易 ，同时探针的设想更多位于外显子区，也极大制止了高GC、反复区等对检测准确性的影响。
图3 交融基因示企图
另一方面，交融基因可能因为交融而招致表达激活，从而产生大量的RNA交融转录本。典型的研究包罗Seo等人颁发的一项关于肺腺癌的转录特征和突变特征的研究[3]，该研究显示不论是ALK交融、RET交融仍是ROS1交融，交融基因的RNA表达量都显著上调（图4）。其原因是交融基因保留了其激酶催化构造域的3’端和交融朋友启动子的5’端，交融朋友在本身发作转录的同时，其下流激酶区域同时发作了转录。即在心理形态下本来不该该转录的激酶区域，在构成交融基因后，其激酶区域转录被激活产生了大量的mRNA。因而，在RNA程度上检测交融基因比DNA程度更敏感，基于RNA停止交融检测的办法也越来越遭到喜爱。
图4 交融转录本因为交融的发作表达量显著上调[3]
详细到RNA-NGS，支流的交融检测道路为RNA-seq，即通过高通量测序手艺停止的转录组测序阐发手艺。常规RNA-seq根据对RNA的富集体例可分为polyA RNA-seq及rRNA depletion RNA-seq。二者的区别在于前者以包被有oligodT的磁珠将总RNA中带有polyA尾的mRNA停止富集后构建文库，然后者接纳rRNA探针将总RNA中的rRNA停止富集后丢弃，对剩下的RNA品种停止文库构建。由此可知，polyA RNA-seq依赖RNA的polyA尾，要求RNA的完好度较高，关于容易发作降解的RNA类型，如FFPE RNA则效果欠安，而rRNA depletion RNA-seq则能够有效克制那一缺陷。然而，两种办法的配合问题在于，虽然都通过对数量占绝大大都（~90%）的rRNA停止了去除（rRNA不具有polyA尾），即对照顾有效信息的RNA停止了必然水平的富集，但实核细胞的表达谱具有转录本数量浩瀚且表达量凹凸差别大的特点。RNA-seq测序成果分离在整个基因组中，差别基因测序深度差别显著，对转录程度偏低的转录本往往测序深度不敷，响应的交融检测效果欠安。因而，在RNA-seq根底上，衍伸出了靶向RNA-seq（Targeted RNA-seq），又叫RNA捕捉测序（CaptureSeq），是指通过寡核苷酸探针杂交，先对RNA文库停止序列靶向捕捉，以富集感兴趣的转录本，再停止测序，从而实现只检测感兴趣的靶标基因RNA转录本的办法（图5）。那一办法能够进步目的转录本的测序深度，停止灵敏的基因发现、有效的转录本组拆和准确的基因表达定量。比拟尺度RNA-seq，具有高灵敏度、宽动态范畴、低成本与高通量等优势。
图5 三种RNA-NGS检交融手艺道路
常规的靶向RNA-seq是在尺度RNA-seq的根底上增加探针杂交富集的过程（图6）[4,5]。此中探针设想有两种形式，一种是基于外显子序列设想，另一种是基于转录本序列设想，两种设想形式的区别在于对外显子接合区（junction site）的捕捉才能有必然差别。也可将两种形式连系起来，在基于外显子设想探针的根底上，增加基于对特定的交融转录本停止针对性的探针设想，间接捕捉交融转录本的接合区，从而进一步进步交融检测灵敏度。
图6 靶向RNA-seq检测流程图[4]
迈杰转化医学基于靶向RNA-seq手艺开发的血液肿瘤156基因交融检测产物HEMECDx panel旨在检测156个血液肿瘤基因相关的交融，更低可检测到0.1-0.5拷贝/ng RNA程度的交融转录本（图7），为血液瘤患者供给更好的辅助诊断、用药及预后提醒。目前，该产物已获得国度创造专利受权。
图7 交融转录本的检测性能验证
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参考文献：
[1] Targetable kinase-activating lesions in Ph-like acute lymphoblastic leukemia.[J]. N Engl J Med, 2014, 371(11):1005-1015.
[2] Tasian S K , Loh M L , Hunger S P . Philadelphia chromosome-like acute lymphoblastic leukemia[J]. Blood, 2017:blood-2017-06-743252.
[3] Seo J S , Ju Y S , Lee W C , et al. The transcriptional landscape and mutational profile of lung adenocarcinoma[J]. Genome Research, 2012, 22(11):2109.
[4] Heyer E E , Deveson I W , Wooi D , et al. Diagnosis of fusion genes using targeted RNA sequencing[J]. Nature Communications, 2019, 10(1).
[5] Mercer T R , Clark M B , Crawford J , et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq[J]. Nature Protocols.
内容：产物研发部 Christina Gu
编纂：Sally
校正：Chao.Z/Grace
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